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保健食品功能学评价程序和检验方法(四)

(1996年7月18日卫监发[1996]38号发布,自发布之日起实行)

??? 3.实验方法
??? 3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
??? 可任选下列方法之一
??? 3.1.1 M法
??? 3.1.1.1 原理
??? 当淋巴细胞受ConA、PA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化,活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解 将M(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲月替(formazan)结晶而显色,其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
??? 3.1.1.2 仪器和材料
??? RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、M、Hanks液、PBS缓冲液(p7.2-7.4)
??? 200目筛网、24孔培养板,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、酶联免疫检测仪、超净工作台
??? 3.1.1.3 实验步骤
??? 完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌,用前加入10%小牛血清,1%谷氨酰胺(200mmol/L),青霉素(100U/ml),链霉素(100ug/L)及5×10-5mol/L的2-巯基乙醇,用无菌的1mol/L的Cl或1mol/L的NaO调p至7.0-7.2,即完全培养液。
??? ConA液 用双蒸水配制成100ug/ml的溶液,过滤除菌,在低温冰箱(-20℃)保存。
??? 无菌Hanks液 用前以3.5%的无菌NaCO3调p7.2-7.4。
??? M液 将5mgM溶于1ml p7.2的PBS中,现配现用。
??? 酸性异丙醇溶液 96ml 异丙醇中加入4ml 1mo1/L的C1,临用前配制。??
?3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备
??? 无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为2×106个/ml。
??? 3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应
??? 将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔1ml,一孔加50ul ConA液(相当5ug/ml),另一孔作为对照,置5%CO2,37℃培养72h。培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液,同时加入M(5mg/ml)50u1/孔,继续培养4h。培养结束后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打混匀,使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中,每个孔分装6孔作为平行样,用酶联免疫检测仪,以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1ml比色杯中,在721分光光度计上比色测定,波长570nm。
??? 3.1.1.4 数据处理及结果判定
??? 一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力,受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值,即可判定该项试验结果阳性。
??? 3.1.2 同位素掺入法
??? 3.1.2.1 原理
??? 淋巴细胞在有丝分裂原PA、ConA等的刺激下,产生增殖反应,DNA和RNA合成明显增加,如在培养液中加入3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞和放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
??? 3.1.2.2 仪器和材料
??? RPMI-1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇(2-ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A (ConA)、Hanks液 、PBS缓冲液(p7.2-7.4)、3H-TdR、闪烁液[2.5-二苯基噁唑(PPO) 0.5g、1,4-双-(5-苯基噁唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500ml混匀]
??? 200目筛网,96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。
??? 3.1.2.3 实验步骤
??? 3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备
??? 无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hanks液洗3次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),最后RPMI1640完全培养液将细胞数调成5×105个/ml。
??? 3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应:
??? 将脾细胞悬液加入到96孔培养板中,200ul/孔,每一份脾细胞悬液分装6个孔,3孔加ConA(5ug/ml),另3个孔不加ConA作为对照。置5% CO2,37℃培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR 20u1,使其终浓度为(3.7-18.5)×104Bq/ml。用多头细胞取集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7ml闪烁液,用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。
??? 3.1.2.4 数据处理及结果判定
??? 一般采用方差分析进行数据统计。以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度,用刺激指数(SI)来表示试验孔cpm 。

 
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